首页 > 百科投稿 > 文章详情

引物浓度(基础篇 参加PCR反应的五大要素)

日期:2022-09-23 03:38:33作者:佚名人气:+

引物浓度(基础篇 参加PCR反应的五大要素)

聚合酶链式反应(PCR)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术,它可看作是生物体外的特殊DNA复制,PCR的最大特点是实现微量DNA的指数倍增加。参加PCR反应的五种物质,分别是:引物、酶、DNTP、模板、Mg2+,进行实验设计时应注意以下几条:

进行PCR的五要素及其条件引物

引物是PCR特异性反应的关键,PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上,只要知道任何一段模板DNA序列, 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则: 

1引物长度

15-30bp,常用为20bp左右。

2引物扩增跨度

200-500bp为宜,特定条件下可扩增至10bp的片段。

3引物碱基

G+C含量40-60%为宜,太少扩增效果不佳,过多容易出现非特异条带。ATGC最好随机分布,避免5个以上的嘌呤和嘧啶核苷酸的成串排列。

4避免引物内部出现二级结构

避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是3'端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带。

5引物3’端的碱基

引物3'端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。

6酶切位点

引物中有或能加上合适的酶切位点, 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点, 这对酶切分析或分子克隆很有好处。

7特异性

引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量:每条引物的浓度0.1~1umol或10~100pmol,以最低引物量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会。

注:bp即base pair,1345 bp DNA ,就是一条有1345个碱基对的DNA;base pair 指示DNA碱基对数目

DNA分子为双链结构 共有4种碱基,即鸟嘌呤(G),腺嘌呤(A),胞嘧啶(C),胸腺嘧啶(T) ,其中G与C配对, A与T配对, 10bp即两条链上各有10个碱基 根据排列组合则可得出4的10次方种组合形式的结论 。

进行PCR的五要素及其条件dNTP的质量与浓度

dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系,dNTP粉呈颗粒状,如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后,以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0~7.5,小量分装, -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中,dNTP应为50~200umol/L,尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制),如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低),就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度降低。

进行PCR的五要素及其条件模板(靶基因)核酸

模板核酸的量与纯化程度,是PCR成败与否的关键环节之一,传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是:溶解细胞膜上的脂类与蛋白质,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜,并解离细胞中的核蛋白,SDS 还能与蛋白质结合而沉淀;蛋白酶K能水解消化蛋白质,特别是与DNA结合的组蛋白,再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份,用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本,可采用快速简便的方法溶解细胞,裂解病原体,消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离,直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法,要防止RNase降解RNA。

进行PCR的五要素及其条件Mg2+浓度

Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响,在一般的PCR反应中,各种dNTP浓度为200umol/L时,Mg2+浓度为1.5~2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高,反应特异性降低,出现非特异扩增,浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性,使反应产物减少。

PCR反应的主要步骤

标准的PCR过程分为三步:

DNA变性(90℃-96℃):双链DNA模板在热作用下,氢键断裂,形成单链DNA

退火(60℃-65℃):系统温度降低,引物与DNA模板结合,形成局部双链。

延伸(70℃-75℃):在Taq酶(在72℃左右,活性最佳)的作用下,以dNTP为原料,从引物的3′端开始以从5′→3′端的方向延伸,合成与模板互补的DNA链。

引物浓度(基础篇 参加PCR反应的五大要素)(图1)

每一循环经过变性、退火和延伸,DNA含量即增加一倍。

PCR扩增反应条件为:94°C预变性10 min;94°C变性0.5 min;55°C退火0.5 min (退火温度根据引物的长度和Tm值来确定);72°C延伸1 min (延伸时间根据所要扩增的目的片段长度,进行调整);30~32个循环 (根据目的片段扩增难易程度而定);最后72°C延伸10 min,降温到25°C预保存5 min。

PCR常用设置如下:

预变性 94℃ 2min

变性 94℃ 30s

退火 59℃ 30s

延伸 72℃ 1min

循环数 30 cycles

后延伸 72℃ 10min

相关推荐阅读

PCR实验室平面布局、通风空调系统设计要点~

*点击关注“洁净园”,获取更多价值干货!

标签:

本站所发布的文字与图片素材为非商业目的改编或整理, 版权归原作者所有, 如侵权或涉及违法, 请联系我们删除, 如需转载请保留原文地址:https://baikequanshuo123.com/109534.html

佚名

倾诉你的情感,分享属于你们的故事
私聊 +关注

Copyright 2005-2020 【白克生活】 版权所有 | 桂ICP备2021009604号-3

声明: 部分信息与图片素材来源于互联网,如内容侵权与违规,请与本站联系,将在三个工作日内处理,互联网不良信息举报邮箱: